Como la secuencia de nucleótidos en los genes determina gran parte de las características de una especie biológica o de virus, de acuerdo con el código genético, el conocimiento de la secuencia de sus genes nos proporciona información sobre el patrimonio genético. La obtención de secuencias completas de nucleótidos o genoma es parte de los esfuerzos de la biología moderna. Por ejemplo, la primera secuencia completa de nucleótidos se obtuvo del virus llamado φX174. En el caso del ser humano, si se logra conocer la secuencia de los genes involucrados en las enfermedades genéticas, así como sus patrones de expresión, será posible en un futuro tratar de diseñar estrategias que contribuyan a corregir ese gen o sus productos a través de terapia génica.
Muchas enfermedades genéticas pueden ser diagnosticadas usando diversas técnicas derivadas de la tecnología del ADN recombinante. La detección de las anomalías se inicia con la obtención de muestras de las vellosidades coriónicas o por medio de amniocentesis. Para la obtención de muestras de las vellosidades coriónicas se inserta un catéter en el útero y se retira una pequeña cantidad de tejido; mientras en la amniocentesis se extrae líquido amniótico que lleva células pertenecientes al embrión.
El siguiente paso es el análisis citogenético, bioquímico y la aplicación de las técnicas de ADN recombinante. Enfermedades como la anemia falciforme (que se caracteriza por la sustitución de ácido glutámico por valina en la cadena beta de la globina) pueden ser detectadas mediante la secuenciación del ADN, mucho antes de que el gen que codifica para la proteína anormal pueda expresarse.
Se han descrito varias técnicas que nos permiten detectar y conocer genes con secuencia normal o variable. Se mencionan algunas a continuación.
Las células fetales son obtenidas de las vellosidades coriónicas o del líquido amniótico y, si son de organismos adultos, de una muestra sanguínea. Se extrae el ADN y se somete a la acción de una enzima de restricción que produce dos fragmentos pequeños del gen normal responsable de la síntesis de la cadena beta de la globina. Si el gen está mutado, la enzima de restricción no reconoce la zona de ruptura en el gen, de tal manera que cuando los fragmentos se colocan en un gel de electroforesis se observa que hay fragmentos pequeños, correspondientes a los genes normales y fragmentos grandes, pertenecientes a los genes mutados.
En este caso se extrae ADN de los leucocitos y se desnaturaliza en hebras simples. Este ADN se usa para amplificar la región donde se localiza el gen de la beta globina con la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se coloca una pequeña cantidad del ADN amplificado a partir del alelo normal de la globina beta (A) en filtros en los que se encuentra una sonda de ADN; de igual modo se coloca una pequeña cantidad del ADN amplificado con el gen responsable de la anemia falciforme (S). Si la sonda se marca radiactivamente o con colorantes fluorescentes, podrá detectarse rápidamente la hibridación y, por lo tanto, podrán deducirse los genotipos: una zona oscura indicará la presencia del homócigo normal (AA), el heterócigo (AS) se detectará por una mancha clara, mientras el homócigo (SS) responsable de la anemia falciforme y que no hibrida con la sonda, no dejará ninguna mancha.
De la tecnología de los oligonucleótidos alelo-específicos se ha derivado la de los microarreglos de ADN o chips de ADN, que pueden usarse para detectar cientos o miles de genes en una misma operación. Los microarreglos se fabrican de vidrio dividido en pequeñísimas zonas. Cada zona contiene varias copias de una sonda constituida por una sola hebra formada por 20 nucleótidos de longitud que difiere de los de la zona vecina en un solo nucleótido.
Actualmente, los chips de ADN son de 200 000 a 600 000 zonas, pero se está desarrollando un chip que puede contener hasta un millón de campos.
El ADN para este tipo de prueba se extrae y se amplifica con PCR; los productos de PCR se marcan con un fluoróforo, se separan en hebras simples y se colocan en el microarreglo. Por otro lado, los fragmentos de la secuencia que coinciden con las sondas colocadas en los campos del chip fluorescerán cuando se escaneen con un láser, mientras las que no concuerden serán eliminadas con un lavado. Finalmente, con este método, reforzado con un software unido al microarreglo, se analizan los patrones de hibridación y permite la detección de mutaciones.
La transferencia de genes normales a las células con la finalidad de corregir desórdenes genéticos se denomina terapia génica. La expresión de un gen que se introduce junto con sus secuencias reguladoras, mediante un vector, resultará en la síntesis de una proteína funcional, que producirá un fenotipo normal en el individuo.
Las técnicas para la introducción de los genes se clasifican en virales y no virales. Los liposomas o vesículas formadas por lípidos constituyen un ejemplo de vector no viral. El ADN que contiene el gen de interés se introduce en los liposomas, que se integrarán a las células por medio de endocitosis. La ventaja de estos vectores es que no desencadenan una respuesta inmune; sin embargo, su eficacia en la transferencia de genes es muy baja. La elección de los virus como vectores se debe al reconocimiento de su capacidad para infectar tejidos, lo que hace de estas partículas un vehículo adecuado para la transferencia génica. El primer vector viral fue el retrovirus responsable de la leucemia Moloney del ratón. Los virus más usados en este tipo de terapia son los retrovirus, los adenovirus y los parvovirus.
La creación de los vectores virales comprende su modificación para eliminar su capacidad de replicación en el interior de la célula blanco. Cuando un retrovirus modificado que porta el gen humano insertado se introduce en la célula blanco por medio de endocitosis, queda dentro de un endosoma en el cual se desensambla. El ARN viral que queda libre en el citosol se retrotranscribe a ADN, el cual se dirige hacia el núcleo para integrarse al genoma humano. La desventaja de este procedimiento radica en que eventualmente el virus puede desencadenar una respuesta inmune, como en el caso de la introducción de adenovirus, que puede incluso provocar la muerte del paciente.
En 1990 se aprobó el primer procedimiento de terapia génica en un caso de inmunodeficiencia severa combinada, resultado de una mutación en el gen que codifica para la enzima adenosina desaminasa. Las personas afectadas presentan severas deficiencias en su sistema inmunológico que las pone en peligro de muerte, incluso cuando se exponen a infecciones leves.
La técnica, desarrollada por W. French Anderson y sus colegas de los institutos nacionales de salud de Estados Unidos, consiste en la extracción de linfocitos, por ejemplo células T del paciente afectado por la deficiencia en adenosina desaminasa. Estas células se cultivan junto con retrovirus a los cuales se les ha insertado el gen normal. Los virus infectan las células T y les introducen la copia normal del gen. Las células T ya infectadas se cultivan en laboratorio para asegurarse de que el gen está presente y que se expresa con normalidad. Finalmente se inyectan en el paciente sus células T modificadas.
El primer caso de inmunodeficiencia severa combinada tratado con esta técnica fue un éxito, pero posteriormente la terapia para esta enfermedad no ha tenido el resultado esperado. Lo mismo ha sucedido con los intentos de terapia para resolver casos de fibrosis quística usando adenovirus como vectores. Los intentos para lograr resultados positivos con la terapia génica han continuado; sin embargo, existen serias dificultades relacionadas con el uso de los virus como vectores de genes.
En primer lugar, existe el problema de que los genes que necesitan ser introducidos a la célula blanco o diana sólo pueden integrarse a su genoma cuando la célula se está reproduciendo; pero las células a las cuales están dirigidos estos genes son células muy diferenciadas, con poca capacidad de reproducción. En segundo lugar, los virus usados como vectores, eventualmente desencadenan una respuesta inmune, que incluso ha causado la muerte en pacientes sometidos a la terapia. En tercer lugar, los genes insertados mediante virus provocan mutación o activación de genes normales de las células blanco o diana, como en el caso de la activación de oncogenes que desencadenan leucemia. Otro inconveniente se refiere a la imposibilidad del virus para aceptar genes que excedan 8kb, pues muchos de los genes humanos exceden este tamaño.
El uso de aerosoles para introducir virus modificados al interior del cuerpo de pacientes afectados por fibrosis quística ha empezado a tener algunos resultados positivos. La enfermedad se debe a una mutación en el gen responsable de la codificación de un transportador de cloro.
Un defecto o la ausencia de esta proteína provoca un desequilibrio en la cantidad de sales y agua que deben encontrarse en el exterior de las células epiteliales de los aparatos respiratorio y digestivo. Como resultado, las células de estos epitelios son recubiertas por un moco espeso, que entre otras cosas provoca infecciones pulmonares que acortan la vida de los enfermos.
El adenovirus, agente responsable de afecciones pulmonares, resulta el vector ideal para introducir el gen normal. Debido a la imposibilidad de infectar in vitro las células pulmonares, el virus debe inhalarse usando para ello un aerosol. Si bien los resultados no han sido totalmente favorables, se espera que la técnica gradualmente sea más efectiva en el tratamiento de esta enfermedad.
